E.coli BL21 plysS와 E.coli BL21

1. 

 

먼저 E.coli BL21의 특징은 우리가 원하는 단백질을 대장규네 형질전환 하고 발현할 시 가장 먼저 선택하는 host입니다. 그 이유는 단백질 분해 효소가 보통 대장균보다 적고 T7 폴리머레이즈를 바탕으로(DE3-BL21중에서도 T7폴리머레이즈가 있는 것을 특별히 DE3를 붙입니다.) 매우 높은 수준으로 발현 할 수 있게 디자인 되있기 때문입니다.


그런데 우리가 원하는 단백질이 독이 있어서 그 단백질이 발현되면 대장균 자체를 죽이는 경우가 있습니다. 그러면 실험 자체가 안되겠죠? 그럴 때 사용하는 것이 E.coli BL21 pLysS 입니다.

작용하는 원리는 배양해서 어느 정도의 수준까지 키움니다. 그 전까지 T7 폴리머 레이즈가 작동하지 못하도록 pLysS 유전자가 억제 시키죠. 그러다가 원하는 수준까지 셀이 자랐다면 IPTG같은 발현 물질을 넣어 주면 그제서야 pLysS가 억제되고 T7폴리머 레이즈를 작동 시켜 2~4시간(시간은 그때그때마다 다름) 동안 발현 시키는 것이죠.

이것보다 독성이 적거나 더욱 많은 단백질을 얻고 싶으면 E.coli BL21 pLysE 라는 대장균을 선택합니다. 이것은 좀더 T7 을 정밀하게 조절하죠.

따라서 단백질 발현 수준을 알아보면 그냥 E.coli BL21(DE3)가 가장 많이 발현하고, 그다음, E.coli BL21 pLysE 가장 적은것이 E.coli BL21 pLysS입니다

단백질 발현양 DE3>pLysE>pLysS 입니다.

 

 

 

2.

 

대부분의 발현벡터에는 T7 promoter가 들어갑니다.(물론 대장균에서 발현하는 경우)
이러한 T7 promoter는 박테리오파지 즉 바이러스로부터 나온 promoter인데 전사의 활성이 높다는 장점이 있지만 무엇보다도 가장 중요한 것은 specificity입니다.

원하는 유전자를 선택적으로 발현하는 것이 실험목적상 좋을 텐데 E.coli에 이미 존재하는 polymerase나 그의 promoter를 이용한다면 원하지 않은 단백질 역시 같이 발현이 될 염려가 있을 것입니다.

그렇기 때문에 다른 종에서 나온 T7 RNA polymerase system을 이용하는 것이고 이 효소의 경우 특이성이 특별히 높습니다.

발현을 목적으로 하는 경우 벡터만이 아니라 E.coli 역시 일반적으로 클로닝할 때 쓰이는 E.coli를 쓰지 않는데 대표적인 BL21 과 같은 strain이 있으며 T7 RNA polymerase를 계속 발현하도록 만든 것입니다.

또 다른 발현 벡터가 가져야 할 중요한 특징은 원하는 시간에 원하는 정도를 발현하도록 만들어져야 하는 것입니다. 이를 Induction이라고 하는데 실험을 하고계신다면 IPTG가 그 역할을 하고 있는 것을 아실 것입니다.

이것은 Lac operon을 이해하시면 되는데 보통 발현벡터에는 T7 promoter 다음에 lac operater가 위치합니다. 이 부분에는 Lac repressor가 결합하고 있어서 평상시에는 T7 RNA polymerase의 작용을 막고 있습니다.

이러한 operater 자리에 결합하고 있는 Lac repressor는 allolactose와 같은 inducer와 결합하면서 떨어지게 되고 이로써 전사가 시작되는 것입니다.
IPTG는 allolactose와 비슷한 구조를 가지며 동일한 기능을 가진 인공화합물로 가수분해되지 않는 특징때문에 allolactose 대신 이용되고 있습니다.

많은 경우 Lac repressor역시 발현벡터에서 계속 발현되도록 만들어지는데 이로인해 위와같은 Indcution 조절이 더 확실하게 되는 것입니다.

또 숙주세포인 E.coli에서의 T7 RNA polymerase 발현 역시 위와같은 Lac operon시스템으로 조절되도록 하는 것도 이용되기도 합니다. 

 

 

출처 : 네이버씨