Ligation 후 Transformation하기

Ligation 후 Transformation하기

 

1. Beed와 selective plate를 37℃에 incuvation.

   - ligation 되기를 기다리는 동안 냉장보관 해 둔 plate에 veed를 20~25개 정도 넣어서

      37℃ incuvator에 미리 데워둔다.

   - selective plate : 우리가 사용하고자 하는 vector가 가진 restriction gene이

                            배양시 발현 될 것이기에, 이 항생제가 포함된 배지를 이용한다.

 

2. competent cell을 준비한다.

    - 얼어있던(-70℃) c.c을 1/3정도는 water bath를 이용해 녹이고(25℃) 나머지는

        실온에서 녹인다(c.c는 녹자 말자 얼음에 박아둔다).

     - c.c의 경우 c.c volume의 최대 10%까지 외부 DNA를 받아들일 수 있다.

 

3. C.C의 volume의 10%보다 적게 ligation 혼합액(plasmid vector + DNA단편)

   을 넣고 1초 vortexing & spin down

    ※ 우리가 사용하는 c.c의 경우, 시중에 파는 제품이라 100λ가 tube에 담겨져 있어서,

        여기에 ligation 혼합액 10λ를 넣어 이용한다는 점을 미리 알린다. 

     - ligation 혼합액은 보통 5~10λ일 경우가 많다. 만약, ligation 혼합액이 20λ 정도라면

       c.c도 200λ정도를 사용하면 된다.

 

4. 얼음에 1~10분 동안 박아둔다(1~10분 사이가 가장 효율이 좋다).

 

5. 얼음에 두었던 mixture를 37℃에 말려놨던 plate + beed에 넣고 plate를 흔들어

    배지가 마를 때까지 micture를 잘 퍼지게 해준다.

    ※ 여기서 Beed란? 보통 고체배지를 만들어 굳힐 때 유리봉을 이용하는데, 그 수고스러

         움을 덜어주는 것으로 Beed(작은알갱이)를 배지에 넣고 흔들어 주면 Beed가 움직이

         면서 배지를 골고루 퍼지게 해주는 역할을 한다.

 

6. 즉시 37℃에 incuvation

 

출처 : kidarime님의 블로그