Ligation Kit을 이용한 DNA Ligation

 

Ligation Kit을 이용한 DNA Ligation

 

실제 우리 실험실에서는 빠른 시간내에 DNA ligation을 하기위해서 DNA ligation kit을 이용한다.

 

* KIT 조성 (TaKaRa)

  ┏ solutionⅠ : 효소액

  ┣ solutionⅡ : 연결 완충 용액

  ┗ solutionⅢ : Transformation Enhancer

      ⇒ circular DNA를 생성하는 ligation 반응 후에 competent cell 내부로의 transformation 전에

          ligation 반응액 전체양의 1/10에 해당하는 solⅢ를 반응액 내에 첨가하여 효율을 증대시킬

          수 있다. 즉, vector ligation시 삽입하고자 하는 DNA양이 적은 경우, 낮은 형질 전환 효율이

          예상될 때 사용한다.

 

 

<실험방법>

 

(Plasmid vector에 DNA 단편을 삽입)

 

 1. Plasmid vector DNA와 DNA 단편의 결합에는 총량 5~10λ가 적당하다.

 

 2. 위의 DNA 용액과 동량의 solⅠ을 첨가하여 충분히 혼합한 뒤, 16℃에서 30분간 반응시킨다

     (반응이 끝난 반응물은 곧바로 E.coli competent cell로 transformation 시킬 수 있다).

     ⇒ competent cell의 경우 c.c양의 10%까지 외부 DNA를 받아 들일 수 있다.

 

        예) Plasmid DNA+DNA fragment(5λ) + 동량의 SolⅠ(5λ) = 100λ c.c에 transformation

 

         if) solⅢ을 사용할 경우

             vector + DNA fragment(5λ) + SolⅠ(5λ), 이 10λ 중 9λ + solⅢ(1λ)를 혼합하여 총 10λ가

             되게 한다. ∵ solⅢ는 전체 부피의 1/10 에 해당하는 양을 사용하기 때문이다.

 

 

출처 : kidarime님의 블로그