SDS-PAGE

 

 

SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis는 생화학과 유전학 및 분자 생물학에 이용되는 단백질 분리 기술로, 그들의 전기 영동 이동성(polypeptide chain의 길이 또는 분자량 뿐만 아니라 Protein folding, Posttranslational modification과 다른 인자들에 의한)을 이용한 기술이다.

 

 

1) SDS-PAGE에서 단백질이 분리되는 원리

 

처음 단백질의 solution은 SDS를 첨가한 후에 분석된다. 이 비 이온화 detergent는 2차 구조와 disulfide bond에 의한 4차 구조를 denature 시킨다. 또한 단백질의 질량에 따라 일정 비율로 각 단백질을 – charge를 띠게 한다.

SDS가 없이는 분자량이 비슷한 다른 단백질들이 protein folding의 차이로 인해서 다르게 이동하는데, folding 방식의 차이에 따라 어떤 단백질들은 겔에서 다른 단백질보다 크기가 더 잘 맞아서 빠르게 이동할 수도 있다. SDS를 첨가함으로 이러한 문제점들을 해결하고 선형으로 단백질을 만들어 분자량(일차구조 또는 아미노산 수)의 크기에 따라 분리할 수 있게 된다. SDS가 단백질에 붙는 비율은 대략 1.4g SDS에 1.0g 단백질이다. 물론 그 범위는 1.1-2.2g SDS/g protein의 비율로 나타날 수 있다. 이 비율은 대략 전체 질량에 비례한다. 대부분 단백질은 이에 따라 오직 단백질의 사이즈만 겔 내 이동거리와 관련되어 겔 속을 움직이게 된다. Tracking dye가 단백질 solution에 첨가되어 실험에서 전기영동 시에 단백질의 이동을 구분할 수 있게 된다.

  

 Denature 된 단백질은 PAG의 Buffer에 잠겨 있는 PAG의 한쪽 끝에 놓는다. 전류가 겔을 통해 흐르면 –charge의 단백질은 anode로 이동하게 된다. Size에 따라서 각 단백질은 다르게 겔을 통과한다. 작은 단백질은 쉽게 겔의 pore를 통과하고 더 멀리가게 된다.. 따라서 정해진 얼마의 시간(전압의 크기에 따라 해상도가 다르며, 수 시간이 소요될 수 있다)이 지나면 size 별로 이동성이 다르게 분리가 되어 있다. 큰 단백질은 시작점에 가까운데 반해 작은 단백질은 더 많이 이동하게 된다. 이후에 Coomassie Brilliant Blue나 silver stain으로 염색한다. 염색이 끝나면 각각의 단백질들은 다른 밴드를 나타내게 된다. Marker 단백질을 사용하여 각 단백질들의 크기를 측정할 수 있다.

2) SDS

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) (C12H25NaO4S; mw: 288.38). SDS는 native proteins을 individual polypeptides로 denature하는 데 사용되는 가장 자주 사용되는 agent이다. SDS를 넣고 100°C에서 단백질을 놔두면 , SDS가 polypeptide backbone을 감싸게 된다. 1.4 g/g polypeptide의 질량 비율로 붙게 된다. 이 과정에서 원래 polypeptide chain의 charge는 SDS의 negative charge에 비해 무시할 정도로 작아지게 된다. SDS 처리후의 Polypeptides는 지팡이 형태의 구조를 가지고 단위 길이당 일정한 - charge 밀도를 가진 형태로 바뀌게 된다. 이 단백질들의 이동성은 분자량에 대수적으로 선형인 함수 관계를 가진다.

3) Stacking gel과 running gel의 역할

불연속 버퍼 시스템은 이온 농도차를 만들어 전기영동의 1차 단계에서 모든 단백질이 하나의 예리한 밴드를 만들게 해준다. 이것은 큰 pore를 가지고 있는 겔 매트릭스가 focusing 또는 stacking gel에서 단백질 이동을 방해하지 않기 때문이다. – ion이 stack 되어 있는 단백질들을 넘어서 1차 버퍼를 넘어가면, 이온 농도차가 사라지고 단백질들은 일제히 resolving 구간으로 넘어가서 단백질 분리가 시작된다.

Stacking gel

Large pore의 polyacrylamide gel(4%)이다. Tris 버퍼는 pH 6.8을 사용하며 전기영동 버퍼보다 2 pH unit이 적은 값을 사용한다. 이 환경은 Kohlrausch reaction을 제공한다. 결과적으로 단백질은 몇 겹으로 뭉치게 되어 Starting zone에 19㎛ 정도로 수 분간 쌓이게 된다. 이 겔은 resolving 겔을 감싸게 된다. Stacking gel 부분은 언제나 샘플의 높이와 양보다 두 배 이상 많아야 한다.

Friedrich Kohlrausch reaction

움직이는 이온의 각각 타입은 특정한 전기 저항성에 의한 것이며, 원래의 분자 조합이 어떤 것인가는 관련이 없다. 따라서 주어진 물질에 관한 이온 이동은 오직 solution의 전기 저항에 영향을 받는다. SDS-PAGE의 경우에는 단백질 역시 크기에 상관 없이 Stacking gel에서 동일하게 움직이게 되며, 이용되는 버퍼들 간의 이온 이동속도는 pH 조건을 사용하여 조절할 수 있다.

Resolving gel

작은 pore의 polyacrylamide gel(3-30%)이다. Tris 버퍼는 pH 8.8을 사용한다. 고분자는 이 겔 안에서 size대로 분리된다. 현재 실험에서 8% gel은 24-205kDa, 10% gel은 14-205kDa, 12% gel은 14-66kDa 단백질을 분리하는데 주로 사용된다.

4) Disulfide bond를 끊어주는 reducing agent

SDS의 첨가에 더해서 reducing agent의 첨가와 boiling이 필요하다. dithiothreitol (DTT) 또는 2-mercaptoethanol (beta-Mercaptoethanol/BME)은 단백질의 disulfide bond를 풀어서 단백질을 denature 시킨다. 그래서 단백질이 4차 구조로 얽히는 것을 방해하며, 4차 구조를 파괴한다. 이를 reducing SDS-PAGE라고 한다.

Non-reducing SDS-PAGE은 boiling이 없고 reducing agent를 첨가하지 않으며, 단백질의 본래 구조를 중요시 여겨 분석할 때 사용한다. 예를 들어 QPNC-PAGE(quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis)는 복잡한 생물 재료에서 본래의 metalloprotein을 분리 하는 데 사용된다.