DNA extraction from soil samples

 

DNA extraction from soil samples

실험전- water bath 65 ℃ set

1. DNA extraction buffer

    100mM Tris-HCl (PH 8.0)

    100mM EDTA (PH8.0)

    100mM Sodium phosphate (PH7.0)

    1.5 M NaCl

    1 % CTAB

    (all autocleaving)

2. 65 ℃ water bath 20 min

3. 20 % SDS final Vol. 1 % 첨가 - votexing 살짝

4. 65 ℃ water bath 30min(long~time)

5. 식힌 후, centrifuge 9000 rpm 20min 4℃

   상등액을 새 tube로 옮긴다.

6. 끝을 자른 tip으로 상등액에  phenol/chloroform/isopropanol 을 1:1 비율로 넣는다.

7. twister 10min (약하게)

8. Centrifuge 8000rpm 20 min

 (6,7,8 번 2번 반복)

9. Isopropanol 0.6 volume 이상 (층생기지 않게) 층이 생기면 dw add!!

   (oakridqe tube)

10. twister 5~10min (약하게)

11. R.T 30min Incubation

12. Centifuge 16,000 rpm 30min

13. Isopropanol 제거하기 위해 D교 oven에서 마를때 까지 (약 1hr 정도 - 틈틈이 확인해서 DNA가 완전 마르지 않도록)

14. 0.1 X TE buffer로 녹인다. (dry oven에서 1ml add)

15. micro tube에 옮긴다. (끝자른 tip 이용)

16. 3ul loading

 

 metagenome은 깨끗하게 뽑히지 않는다.

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CTAB ： cetyltrimethylammonium bromide = cetrimonium bromide

           핵산과 결합하여 complex를 이룬다. centrifugation 시 DNA를 down 시킨다.

Isopropanol을 첨가했을 때, 층이 생기지 않도록 하는 이유!!

 lsopropanol의 oil 층이 생기면 DNA가 down이 잘 되지 않기 때문에 희석을 해서 oil층이 생기는 것을 억제한다.

Dry oven에서 pellet을 말릴 때, 제대로 말려지지 않으면 propanol이 아직 다 날라가지 않아서 DNA의 수율이 낮아지게 된다. 그렇다고 너무 바짝 말리게 되면 TE buffer에 의해 충분히 녹아지지 않아 DNA를 얻기 힘들다.