혐기성 미생물의 생장을 위한 환원 배지 조제

 

『Anaerobe Laboratory Manual (혐기성 미생물을 다루는 실험지침) , 제4판 ,1977, Virginia Polytechnic Institute and State University刊』에서 인용

 

  환원배지를 만들기 위해서 다음과 같은 과정을 거친다.

1) 산소를 제거하고 배지를 끓여 내용물을 부분적으로 환원시킨다.
        2) cysteine을 넣어 한번 더 환원시킨다.
        3) 산소를 제거한 기체를 흘려보내 배지를 산소가 없는 상태로 유지하고 마개를 꼭 닫는다.

   resazurin Eh 지시약이 파란색에서 분홍색으로 변할 때(지시약 dilution blanks로 10분간)까지 배지를 끓인 후 배지를 식힌다. 식히는 동안 산소가 없는 이산화탄소를 통과시켜 배지 내로 이산화탄소가 녹아들게 한다.

  그런 다음 환원제를 넣어 배지의 Eh 농도를 더욱 낮춘다. 배지를 끓여 일차로 환원시킨 후 환원제(cysteine hydrochloride)를 넣으면 환원제가 최소로 산화하게 될 것이다. 산화된 환원제는 배양조건이 까다로운 혐기성 미생물에 독성을 나타낼 수 있다.

  고압증기멸균을 마친 배지의 pH는 대략 7.0 (대부분의 경우 7.0±0.2정도)이 되어야 한다. 배지가 아주 약간 완충되어 탄수화물이 산화해 생긴 산성물이 pH변화를 일으킬 수 있다. 탄수화물도 배지에 들어가 멸균되므로 멸균과정에서 탄수화물이 변성되는 것을 막기 위해, 중성에 가깝게 맞추는 것이 바람직하다.

  환원제를 배지에 넣고 8 N의 수산화나트륨과 이산화탄소로 pH를 조정한다. 멸균하는 동안 pH가 변할 수도 있다. 최종 pH가 7이 되게 하기 위해서는 수산화나트륨으로 멸균 직전에 바람직한 pH보다 0.1이나 0.2정도 올려놓고 배지에 이산화탄소 기체를 녹여 적정 pH로 낮춘다. 멸균 전 pH가 맞춰지면 산소가 없는 질소가스를 투입시켜 배지의 pH가 더 낮아지는 것을 방지한다.

  배지를 시험관에 옮겨 담을 때의 온도가 최종 pH에 영향을 미칠 수도 있다. 모든 배지가 동일한 온도조건 하에서 시험관에 옮겨지면 최종 pH는 재현성이 있게 된다. 배지가 식기 전에 시험관에 옮기면 상온에서 시험관 안이 진공상태로 되어 뚜껑을 열었을 때 안으로 공기가 빨려 들어가게 된다. 반면 너무 식은 배지를 시험관에 넣을 경우, 상온에서 압력이 높아져 저장 중 뚜껑이 열릴 수 있다. 그러므로 상온과 비슷한 온도로 배지를 식혀 시험관에 넣도록 한다.

  수산화나트륨 용액이 산소를 포함하고 있기 때문에 배지에 수산화나트륨을 첨가하면 배지 내의 resazurin이 분홍색으로 변한다. 이런 현상이 발생할 경우 배지에 환원제를 첨가하여 resazurin이 무색이 되게 한다. 환원당을 포함하지 않은 배지(예, dillution blanks, PY 등)는 대개의 경우 수산화나트륨을 첨가하면 분홍색으로 변한다. 이럴 경우에는 사용하기 전에 수산화나트륨을 살짝 데워서(부식성) 사용하면 된다.

  멸균 후에 분홍색으로 변한 시험관들은 모두 폐기처분 한다.

 

 배지 제조 과정

1. 분말 시약들의 무게를 잰다. 사용하기 직전에 재거나 미리 재어 시험관에 뚜껑을 닫아 보관한다. 〔표준 시약들은 무게가 측정된 용기를 이용해 무게를 잰다. 새로운 시약을 잴 때는 눈금을 다시 맞춰야 한다.〕

2. 분말 시약들을 플라스크에 담는다. 여기에 물과 염용액, resazurin을 넣는다. 플라스크는 가루시약의 양보다 조금 더 큰 것을 사용해 그 안에 공기가 많이 차는 것을 방지한다. (예를 들어 시약의 부피가 500 ㎖ 라면 750 ㎖의 플라스크를, 시약이 750 ㎖ 라면 1 L 플라스크를 쓴다.)

3. 배지가 끓어 넘치는 것을 방지하기 위하여 플라스크 위에 벗겨낼 수 있는 뚜껑을 덮는다. 뚜껑으로 사용할 만한 것은 16 oz polypylene bottle, pyrex glass joint (standard taper 24/40, inner part), stopper등이 있다. 플라스틱 병의 바닥에 구멍(직경 약 1/2인치)을 뚫는다. glass joint의 한쪽 끝을 병의 입구에 묶어주고 고무마개에 뚫어진 구멍 안으로 glass joint의 다른 끝을 넣는다.

4. 배지를 일정하게 끓이기 위해 끓임쪽이나 유리구슬을 넣어주거나 가열식 자석교반기를 사용한다.

5. resazurin이 푸른색에서 분홍색으로 변할 때까지 배지를 끓인다(보통 5~10분 소요).

6. 불을 끄고 플라스크의 뚜껑을 구멍이 두 개 뚫린 고무마개로 바꿔 막고 한쪽에 cannula를 꽂고, 한쪽 구멍으로는 배지 안으로 이산화탄소 기체를 흘려보내 플라스크 내의 공기를 바깥으로 빼낸다.

7. 얼음조에 배지를 넣고 배지 온도를 상온까지 떨어뜨린 후(이때도 계속 이산화탄소를 흘려보낸다.) 다 식으면 얼음조에서 플라스크를 꺼낸다.

8. cysteine을 넣는다.

9. 8N의 수산화나트륨 (또는 5 N의 염화수소)을 넣어 pH를 7.0-7.1로 맞춘다. pH가 6.9로 떨어질 때까지 배지에 계속 이산화탄소를 흘려보낸다. 멸균 후에 pH를 7.0+0.2로 맞춘다.〔적정 pH보다 0.2정도 높게 pH를 맞춘 후 배지에 이산화탄소 기체를 불어넣어 적정 pH로 낮춘다. 주어진 값은 실험실에서 사용하는 용도에 맞게 조정하는 것이 좋다. 바람직한 결과는 멸균 후 배지의 pH가 7.0이 되는 것이다.〕

10. 적정 pH로 맞춘 후 무산소 질소가스를 흘려 넣어 공기를 빼낸다.

11. 무산소 질소가스를 계속 흘려 넣으면서 배지를 시험관에 분주한다. 2개의 cannula(하나는 배지펌프에 쓰고 다른 하나는 무산소 질소용으로 쓴다)가 붙은 배지펌프를 사용하면 쉽게 시험관에 옮겨 담을 수 있다.

12. cannula로 쓰인 고무마개로 된 뚜껑(예를 들어 Fisher14-130)을 시험관에서 뺀다.

13. 시험관 뚜껑을 닫고 받침대에 받쳐 멸균기에 압력을 높인다.

14. 121℃(15lbs)에서 멸균한다. 빠른 배기장치가 있는 것을 사용한다.

15. 식힌 후 받침대에서 꺼내어 라벨을 붙이고 상온에서 보관한다. 이때 resazurin의 활성이 떨어지지 않게 하기 위해서 직사광선을 피해서 보관한다. resazurin이 산화(배지 내의 resazurin이 분홍색으로 변함)되기 전까지는 배지를 사용하는데 문제가 없다.

 

   환원한천배지를 시험관에 만들기 위해서 적당량의 한천을 시험관에 집어넣고 환원 배양액을 부어 멸균시킨다. 고압증기멸균기에서 시험관을 꺼내어 몇 번 뒤집어서 잘 섞는다. 한천을 시험관에 넣을 때는 정확한 측정기구를 사용하여 한천배지를 새로 개봉할 때마다 동일한 양이 들어있도록 한다. : 이전 양과 동일한 부피비를 갖도록 한다. 배양액을 분배하기 전에 젤라틴이나 여타의 다른 고형제도 각 시험관에 넣도록 한다.

 

  둥근 유리시험관에 streaking할 경우에는 최소 2%이상 한천을 넣도록 한다 (많을수록 좋음). '배지분주용 시험관'에 사용되는 한천배지의 경우 한천을 2%이상 사용하지 않는다. 그렇지 않으면 시험관에 접종하기 전에 배지가 굳거나 47-50℃로 식혔을 때 가는 줄 같은 것이 생길 수 있다(몇몇 미생물의 경우 고온이 치명적임).

 

  환원배지를 분주하는 사람은 안전장갑을 껴서 베지 않도록 주의한다. 이것을 지키지 않거나 배지를 만드는 사람들에게 숙지시키지 않는다면 보험료가 그만큼 인상될 거라는 걸 알아야 한다. 배지를 만드는 과정에서 시험관이 깨지는 것 또한 주요 문제가 될 수 있다. 시험관에 금이 가 있는 경우, 처음 마개를 끼웠을 때나 멸균 시 깨질 수 있기 때문이다. 그러나 두꺼운 유리로 된 시험관을 사용한 이후로는 여타의 실험에서 심각하게 깨지는 경우를 보지 못했다.

 주의: 배지의 종류에 따라 다른 종류의 기체를 사용할 수 있다.